آموزش ساخت ژل الکتروفورز | انواع ژل الکتروفورز

آموزش ساخت ژل الکتروفورز

الکتروفورز یکی از روش‌های کلیدی و پرکاربرد در علوم زیستی و مولکولی برای جداسازی مولکول‌هایی همچون DNA و RNA است. در این تکنیک، ژل الکتروفورز نقش حیاتی ایفا می‌کند و به عنوان ماتریسی برای جداسازی مولکول‌ها بر اساس اندازه و بار الکتریکی آن‌ها به کار می‌رود. در این مقاله به آموزش جامع ساخت ژل الکتروفورز، به خصوص ژل آگاروز، و همچنین معرفی و مقایسه بافرهای TAE و TBE پرداخته شده است.

فرآیند ساخت ژل الکتروفورز

در تکنیک الکتروفورز، برای ساخت ژل از موادی مانند آگاروز یا پلی‌آکریلامید استفاده می‌شود. این مواد به صورت پودر در اختیار کاربر قرار می‌گیرند و پس از مخلوط با بافرهای مخصوص و حرارت دادن، به یک مایع شفاف تبدیل می‌شوند. بر اساس غلظت مورد نظر، مقدار مشخصی از پودر را در بافر TAE یا TBE مخلوط و حل می‌کنیم. سپس مایع شفاف حاصل را درون کاست ژل می‌ریزیم و آن را در محفظه‌ای به نام تانک الکتروفورز قرار می‌دهیم. با استفاده از شانه چاهک، چاهک‌هایی برای قرار دادن نمونه‌ها آماده می‌کنیم. پس از خنک شدن، مایع به شکل ژل بسته می‌شود و خنک می‌شود.

تانک الکتروفورز و بافرها نقش کلیدی در ایجاد جریان الکتریکی و عبور آن از ژل را دارند. در این تانک، دو الکترود متصل به یک منبع برق قرار می‌گیرند که جریان الکتریکی کنترل شده را ایجاد می‌کند.

برای مشاهده نمونه‌ها روی ژل، هنگام قرار دادن آن‌ها درون چاهک، از رنگ‌های قابل مشاهده با نور UV مانند DNA safe stain استفاده می‌شود.

البته در گذشته، از اتیدیوم بروماید برای رنگ‌آمیزی استفاده می‌شد، اما به دلیل سمیت و جهش‌زا بودن آن، کار با آن در آزمایشگاه‌ها ممنوع شده است. پس از پایان حرکت مولکول‌ها به سمت قطب مخالف، جریان الکتریکی قطع می‌شود و ژل توسط دستگاهی به نام ژل داک تصویربرداری می‌شود. در این دستگاه، تصاویر ژل ثبت و تحلیل می‌شوند.

تهیه ژل آگاروز

برای تهیه ژل آگاروز، ابتدا بر حسب نوع نمونه و اندازه مولکول‌هایی که قصد جداسازی آن‌ها را دارید، غلظت مناسبی از پودر آگاروز (معمولاً بین 0.7 تا 2 درصد) را در بافر TAE یا TBE حل می‌کنند. به عنوان مثال، تهیه ژل با 2 درصد آگاروز به معنای افزودن 2 گرم پودر آگاروز به 100 میلی‌لیتر بافر است. با حرارت دادن مخلوط تا زمان حل کامل آگاروز و شفاف شدن محلول، ژل آماده ریختن در قالب می‌شود.

در نظر داشته باشید که تانک الکتروفورز را با همان بافری که برای تهیه ژل استفاده می‌کنید، پر کنید. زیرا این هماهنگی موجب عبور بهتر جریان الکتریکی و عملکرد بهینه فرآیند الکتروفورز می‌گردد. بعد از حل شدن پودر آگاروز در بافر و تبدیل آن به مایع شفاف، می‌توانیم ژل را درون تانک الکتروفورز قرار دهیم و برای جداسازی و شناسایی مولکول‌ها از آن استفاده کنیم.

مواد لازم برای تهیه بافرها با توجه به نوع مولکول‌ها و هدف جداسازی مورد نظر انتخاب می‌شود.بافرها بسته به نوع مولکول و هدف جداسازی تهیه می‌شوند.

برای تهیه بافر TAE یا Tris/Acetate/EDTA، از تریس (Tris-base)، استات (Acetate) و EDTA به همراه آب استفاده می‌شود.

در صورتی که بافر TBE یا Tris/Borate/EDTA را می‌خواهید تهیه کنید، از تریس، بوریک اسید (Boric acid) و Na2EDTA استفاده می‌شود.

هر دو بافر پس از تهیه، برای ساخت ژل و پر کردن تانک الکتروفورز استفاده می‌شوند.

مقایسه و کاربرد بافر TAE و بافر TBE

بافر TAE و بافر TBE دو نوع بافر اصلی برای استفاده در الکتروفورز DNA هستند. هر کدام از این بافرها خصوصیات و کاربردهای خاص خود را دارند.

بافر TAE
این بافر به دلیل قابلیت رسانایی مناسب و ایجاد محیطی ایده‌آل برای جداسازی قطعات بلند DNA شناخته شده است. همچنین در الکتروفورزهای طولانی، کیفیت جداسازی ارائه‌شده توسط این بافر مطلوب است و می‌تواند باندهای DNA را واضح نشان دهد.

بافر TBE
این بافر معمولاً برای جداسازی قطعات DNA با طول حدود 2 کیلوباز بسیار کاربردی است. ویژگی برجسته TBE توانایی ایجاد باندهای دقیق‌تر و واضح‌تر نسبت به TAE است. همچنین این بافر برای الکتروفورزهای طولانی مناسب بوده و در آزمایش‌هایی که نیاز به تفکیک دقیق قطعات کوچکتر DNA دارند، ترجیح داده می‌شود.

هر یک از این بافرها بر اساس نیازها و هدف از الکتروفورز DNA انتخاب می‌شود. اگر برای جداسازی قطعات بلند DNA هستید، بافر TAE مناسبتر است. اما اگر هدف شما شناسایی قطعات DNA با طول 2kb است و یا می‌خواهید الکتروفورزهای طولانی انجام دهید و همچنین برای سرعت و دقت بیشتر در تفکیک قطعات کوچک‌تر، بافر TBE بهترین گزینه است. همچنین، با توجه به خصوصیات مشخصه هر بافر، ممکن است نیازمندی‌های خاص شما را برآورده کند.

تهیه ژل پلی آکریلامید

برای تهیه ژل پلی آکریلامید، ابتدا مقدار مشخصی از پلی آکریلامید و بیس آکریلامید را با یک حجم مشخص از آب ترکیب می‌کنیم. این مواد را به خوبی مخلوط می‌کنیم تا یک محلول یکنواخت و بدون گوده‌ها تشکیل شود. سپس، این محلول را از طریق یک فیلتر تخلیص می‌دهیم تا احتمال وجود ذرات یا ترکیبات ناخواسته در ژل کاسته شود.

بعد از تخلیص محلول، آن را در یک کاست ژل قرار می‌دهیم. قبل از ریختن محلول در کاست، مقدار کمی آمونیوم پرسولفات و TEMED را به آن اضافه می‌کنیم. این دو ترکیب به عنوان عامل‌های پلیمریزاسیون عمل می‌کنند و باعث می‌شوند فرآیند تشکیل ژل پلی آکریلامید سریع‌تر انجام شود. برای ایمنی، توصیه می‌شود با TEMED در شرایط خاص ایمنی و تحت هود آزمایشگاهی کار کنید، زیرا این ماده بسیار خطرناک و جهش زا است.

پس از ریختن محلول در کاست، ژل را در دمای اتاق و در فضای تاریک قرار می‌دهیم. این شرایط کمک می‌کنند تا فرآیند پلیمریزاسیون به خوبی انجام شود و ژل به صورت صحیح خود را تشکیل دهد. پس از تثبیت ژل، می‌توان از آن در الکتروفورز عمودی استفاده کرده و با کمک جریان الکتریکی، پروتئین‌ها و مولکول‌های DNA کوچک و تک رشته‌ای را جدا کرد. ژل پلی آکریلامید یک روش معمول برای جداسازی و شناسایی این نوع مولکول‌ها است و در تحقیقات بسیاری در زمینه علوم زیستی و ژنتیک استفاده می‌شود.